Итак, настало время продолжения статьи о том, как все же сделать светящуюся елку к следующему новому году с применением настоящей генной инженерии, а не той, о которой вы до этого могли прочитать в новостях :)
Краткое содержание
предыдущей серии:
Ученые открыли ген синего свечения. Мы прочитали об этом гене и загорелись сделать светящуюся трансгенную елку. Нашли в специализированных ресурсах его название и последовательность, выбили командировку у шефа и скатались туда, где живет животное – бутявка, в которой содержится этот ген.
Путем различных ухищрений с применением специального оборудования мы получили чистые молекулы ДНК гена bl1, кодирующего белок синего свечения.
У нас есть ген. Чего же мы ждем, спросят читатели, давайте засунем этот ген в елку и она начнет светиться?
Не все так просто, и вот, почему.
Любой ген работает только когда с него считывается информация. В нашем случае это мРНК белка bl1. Более того, сама мРНК должна работать, но это отдельная история.
Второе – ген должен передаваться при делении клетки ее потомкам. Иначе все пойдет насмарку.
Третье – ведь ген это не булавка, его еще засунуть как-то нужно!
Если мы просто поместим в клетку ген, то ни информация с него не будет прочитана, ни передаваться он не будет (да, собственно, и с засовыванием его большие проблемы). Поэтому, мы должны навесить на него какую-нибудь служебную информацию, которая бы позволила ему работать и облечь в форму, которая позволит передаваться потомкам. А так же каким-то образом занести его в клетку.
Однако еще раньше мы постараемся сохранить имеющийся ген, чтобы в любой момент можно было его получить много и не ездить за бутявкой.
Первая трансформация.
Самая первая задача, которая стоит на каждом этапе – сохранить результаты предыдущих этапов. Актуальная задачи и в программировании, не правда ли? :)
Сейчас мы поместим наш ген в бактерию, так, чтобы в любой момент мы могли ее размножить и достать оттуда необходимое количество. Это будет наш первый трансгенный организм и процесс его создания называется трансформацией.
Почему мы просто не можем размножить ген с помощью ПЦР, как мы делали до этого? Дело в том, что вероятность ошибки в реакции ПЦР 1/10^3, а в бактерии 1/10^6, то есть копирование его происходит в тысячу раз точнее, а точность нам нужна абсолютная и чем больше, тем лучше.
Итак, помещаем ген в бактерию, как же это сделать? Для этого для начала подготовим контейнер — специальную кольцевую молекулу ДНК, называемую
плазмидой. Эта плазмида может плавать в клетке бактерии независимо от ее генома, размножаться и передаваться потомкам, так как у нее есть необходимые для этого гены и сигнальные последовательности.
Так же в плазмиде есть гены
маркёры. Это такие гены, которые помогут нам отобрать клетки с плазмидой, от клеток где ее нет. Маркёром, например, может быть ген окраски (бактерии с плазмидой будут окрашены) или устойчивости (бактерии с плазмидой не умрут на среде с антибиотиком).
Плазмиды можно купить в биотехнологической компании, их продают всем желающим. Прийдет она к вам в виде прозрачного раствора в небольшой пробирке (собственно, так же выглядит раствор любой другой ДНК). Для вставки гена в плазмиду ее нужно надрезать ферментом — рестриктазой (речь о ней пойдет далее), но часто они продаются уже надрезанными.
Допустим мы купили современную плазмиду, например
pJET1,2 от Fermentas.
Вот она, красавица. В верхнем правом углу много мелких названий – это перечислены сайты рестрикции. Rep – это участок отвечающий за репликацию (размножение) плазмиды в клетке, а Amp – репортерный ген устойчивости к антибиотику – ампициллину.
К плазмиде поставляется набор реактивов, так называемый “кит”. Мы капаем по инструкции чуть чуть раствора нашего гена, плазмиды с реактивами из кита и фермента лигазы и получаем раствор, где молекулы плазмиды соединились с молекулами гена и получилась единая кольцевая молекула, содержащая ген bl1.
Такую плазмиду называют “плазмида со вставкой”.
Фермент лигаза сшивает пристыкованые друг к другу участки ДНК. Она сшивает все подряд и не может определить, правильно ли все пристыковано (например, может просто сшить плазмиду саму с собой, вовсе без нашего гена), поэтому наша задача делать так, чтобы стыковаться молекулы могли только определенным образом. Чуть дальше я расскажу об этом, когда пойдет речь о липких концах.
Плазмида pJet1,2 продается уже разрезанной посередине гена eco471R. Это ген кодирует клеточный яд – мощную рестриктазу, которая убъет клетку если лигаза сошьет плазмиду без вставленного гена bl1 и такая плазмида попадет в бактерию. Это очень удобно, так как нам не нужно беспокоиться, что вырастут бактерии, в которых вовсе нет вставки, что бывает с другими типами плазмид (этот тип назван плазмидой-самоубийцей или “selfkill plasmid”).
Изначально эта информация выходила за рамки статьи, но я подумал, что иначе будут вопросы, зачем этот ген :)
Далее берем специально подготовленную культуру бактерий кишечной палочки (Echerichia coli или E.coli) и по протоколу трансформации капаем в них раствор плазмиды со вставкой. Протоколы могут быть разные, вот
пример. Бактерии очень легко поддаются трансформации, по сути ДНК просто в них проникает и все, никаких других ухищрений.
Обычно трансформацию делают вечером, наутро бактерии подрастают и мы уже имеем результаты.
На чашке Петри со средой для роста, имеется множество колоний. Каждая колония — потомки одной единственной трансформированной клетки. Мы выбираем некоторые из них, тестируем на содержание bl1 методом ПЦР (чтобы убедиться в наличии гена) и можем положить на хранение.
Бактерии растут очень быстро и теперь плазмиду с геном можно выделить из них в любой момент в нужном количестве
Итак, мы засейвились :) и параллельно получили культуру трансгенных бактерий. Будут они светиться или нет зависит от того, какую плазмиду для трансформации мы выбрали, есть ли в ней сигнальная последовательность для синтеза мРНК – промотор.
Отмечу, что вот такое сохранение промежуточных результатов всегда проводят в бактериях, независимо от того, с каким далее объектом происходит работа. Просто с ними очень удобно работать и хранить (быстро заморозив в жидком азоте).
Подготовка транскрибирующейся последовательности.
Чтобы последовательность гена работала в клетке, с нее должна прочитываться мРНК(а с нее — белок), то есть она должна транскрибироваться. Для того чтобы это произошло, перед геном обязательно должна стоять управляющая последовательность –
промотор.
Промоторы есть у всех генов и они отвечают за то, в каких условиях должен синтезироваться ген, однако определенные промоторы работают только в определенных организмах. Так, бактериальные промоторы не работают у растений и наоборот, растительные – в бактериях. Так как мы хотим, чтобы елка светилась ярко, то поставим ген под суперпромотор, который работает постоянно. Для растений им может являться промотор
35S из вируса мозаики цветной капусты.
К счастью на не нужно искать этот вирус и цветную капусту :) Можно купить уже готовую плазмиду, содержащую промотор и имеющую место для вставки гена. Например, такую как на рисунке.
Следующий шаг — мы
выделяем плазмиду со вставкой из культуры бактерий и вырезаем оттуда ген. Вырезание производится с помощью ферментов-рестриктаз (просто к раствору плазмидной ДНК добавляем фермент и буфер для работы фермента). По бокам от встроенного нами гена в плазмиде содержатся участки ДНК (сайты рестрикции), которые ими узнаются и происходит разрезание.
Всегда нужно выбирать те рестриктазы, которые будут резать только в одном месте, не разрезая сам ген (определенная рестриктаза всегда узнает определенный сайт, который состоит обычно из 6 определенных нуклеотидов). Например, рестриктаза EcoR1 всегда разрежет ДНК если обнаружит в ней последовательность G'AATTC, причем резать будет и одну цепь и вторую.
Если рестриктаза режет не точно посередине последовательности узнавания, то по краям остаются так называемые “липкие концы”, где часть ДНК одноцепочечна. Такие концы имеют свойство “липнуть”- пристыковываться к другим липким концам с той же последовательностью одноцепочечных участков. Если последовательность будет иной, то стыковки не произойдет. Таким образом если мы вырежем ген двумя рестриктазами – одной для начала гена и другой для конца, то начало и конец его будут иметь разные концы, которые соединятся только с себе подобными. Это очень важно для контролирования ориентации гена, ведь работает он только если повернут определенным образом к служебным последовательностям.
Некоторые рестриктазы могут порезать четко посередине и получим “тупые концы”. По тупым концам тоже можно сделать сшивку, но получится 50% вероятность пришить ген не той стороной которой нужно, а задом наперед.
После вырезания гена очищаем его от остатков плазмиды с помощью электрофореза.
Аналогичным образом разрезаем купленную плазмиду с промотором и смешиваем ее с вырезанным геном.
Добавляем лигазы и вуаля – имеем сшитую последовательность, где у нас имеется промотор 35S и ген bl1.
Снова трансформируем бактерии, уже этой полученной конструкцией. Так как мы ввели промотор, работающий у растений, то светиться такие бактерии не будут. Если бы мы ввели бактериальный промотор, то на этом шаге культура бактерий бы засветилась.
Плазмида с промотором, геном, маркёрами и другими служебными частями называется “плазмидой для экспрессии”. Ее уже можно использовать для получения трансгенных растений.
Это у нас второе сохранение. Мы уже знаем как заставить бактерии светиться и получили почти все необходимое, чтобы получить трансгенные растения.
Заметьте, процесс генноинженерной работы многоступенчатый и многозадачный. В реальной жизни одновременно происходит работа с 3-4 экспериментами находящимися на разных стадиях. Пока в одном растут бактерии, для другого мы проводим рестрикцию плазмиды, а для третьего выделяем ген. Происходит это из-за того, что никогда не бывает настолько идеально гладкого хода работ, как я описал, всегда возникают проблемы по разным причинам, их приходится обнаруживать, преодолевать. Даже на выявление ошибки на каждой стадии уходит минимум несколько часов.
И именно для преодоления проблем нужен весь объем знаний молекулярного биолога, а не для последовательного капанья из одной пробирки в другую, чем может заниматься и лаборант :)
Но о том, как же мы все-таки получим светящуюся синим елку, я расскажу в заключительной статье. Там же приведу список оборудования и реактивов, с ценами :)
UPD:
Часть 3, заключительная.
комментарии (68)
Интересуют такие вопросы:
1) Куда лучше идти учиться, чтобы заниматься генной инженерией и получить максимум практики (в качестве второго высшего образования наверно, интересуют ВУЗы России и Украины, конкретно названия факультетов)
2) Сколько лет нужно учиться, если уже есть высшее образование (специалист/магистратура) в области IT.
2) 5 лет.
3) Биология или Физика, Химия, Математика, Русский
2. Если хорошо взяться за дело, то это года 2-3.
Но я не советую не бросать IT в любом случае. Очень актуальная область сейчас — это биоинформатика, там требуются навыки как биологов, так и программистов.
С другой стороны, достойная работа во всех этих областях есть пока только на западе.
По поводу биоинформатики — да, это для меня очень интересно.
Просто думаю сейчас — податься мне в аспирантуру или получить высшее в области биологии (думаю что второе все-таки более расширит мой кругозор и откроет новые горизонты для исследований, больше всего интересует генная инженерия и нейробиология, я нахожу эти направления весьма интересными в связке с IT).
Как вариант — идти в аспирантуру именно на биоинформатику.
Кроме того в случае с аспирантурой — у меня есть своя тема, по которой я хотел бы писать научную работу в области IT (пока только проблема найти преподавателя, которому эта тема была бы так же близка), работать над другими темами, которые навязывают преподаватели мне не так интересно.
Что касается биологии — я хочу для начала получить необходимый для каких-то научных работ уровень знаний (2-е высшее), а потом уже думать, чем конкретно в этом направлении я хотел бы заняться.
А статья интересная.
* Уехал отлавливать бутявок :)
В общем, очень интересно) Спасибо за статьи.
Раньше как-то не задумывался о том, как работают генетики.
Огромнейшее спасибо за написание столь сложного и интереснейшего материала :)
…но здорово его напоминает.
А сейчас читаю про то, что кто-то покупает на фирме красавицу-плазмиду (!) и инсталлирует туда гены (!!). Здорово. Ощущения смешанные. С одной стороны, это всё безумно круто и интересно. А с другой стороны, как же каждый из нас далёк едва ли не от всего остального… Если бы тут появился человек, который бы рассказывал про ремонт электровозов, и там бы нашлось куча всего интересного, наверно.
Мне вот что реально интересно. Разные области науки-техники ведь могут быть очень полезны друг другу. Понятно, что то же программирование в той же биологии может весьма помочь. Но как много специалистов с двойным образованием, которые на практике сумеют заполнить промежутки между направлениями в науке-технике?..
Программирование тут не просто может помочь, без программирования (т.е. без программ для обработки) это вообще невозможно. Учитывая достижения в технологиях секвенирования, наиболее актуальной становится именно задача обработки.
Специалистов тут не нужно какое-то сверхъестественное число. Но тех что есть — маловато.
Но это верхушка айсберга, это лежит на поверхности, и любой, кто чисто теоретически знает, что нуклеотиды можно кодировать буквами, чисто теоретически может предположить пользу строковых алгоритмов.
Немного в сторону. Я года четыре назад был в одной больнице у знакомого доктора, видел их жизнь изнутри. Вроде у них и компы везде стоят, и как бы автоматизировано-компьютеризовано. Но для меня это выглядело почти так, как будто бы они компьютерами гвозди забивают. То есть мне бы знать их врачебную специфику, я бы им workflow так наладил, как им и не снилось.
То есть мне кажется (и это касается не только геномики и биологии вообще, а чуть ли не любых двух специальностей X и Y), проблема в том, что специалист в X не знает, что может пригодиться специалисту в области Y. А специалист из Y не знает, чем хотя бы теоретически ему может быть полезны знания спеца из X.
Другой впечатливший меня пример. Пару лет назад одна преподавательница усиленно продвигала метод обучения, весьма упрощённо описывающийся как «сначала даём задачи решать, а потом уже теорию, нужную для решения этих задач». Какие-то статьи писала, экспериментировала. А потом появился на горизонте некий инженер-математик, который пожал плечами и сказал, что всё это очевидно, что получается система с положительной обратной связью, и что он может легко формально доказать, что всё это работает :)
Но ведь преподавательнице и в голову бы не пришло спросить математиков-инженеров про их формальные методы!
Мне очень часто приходится работать без ТЗ. Замечал, что даже если максимально подробно и долго распрашивать, из вида может ускользнуть какая-то деталь, заказчики могут что-то не то рассказать, о чём-то забыть, что-то не предусмотреть. Фактически, системный аналитик должен обладать навыками получать максимально полную информацию о требуемой системе. Я так понимаю, что системные аналитики бывают в разных сферах, но совсем не обязательно им иметь 2 высших образования.
Кстати, так же посмотрите язык UML (universal markup language) — средство описания любых объектов, задач, целей. Зачастую результатом работы системного аналитика и является схема в UML.
У елки органа не появится, просто она будет вырабатывать светящийся белок и начнет светиться вся целиком.
Бутявка Марина, которая живёт на Мальдивах.
Насчет светляка же вообще все интересно. Светится ведь не сам светляк, а симбиотические бактерии в его светящемся органе. А регулирует свечение он перекрывая им кислород, в прямом смысле (сжимая или разжимая подводящие кровеносные сосуды).
Т.е. при облучении зелёным светом мы видим красный? :)
При этом неплохо бы конечно закодировать в клетке и люциферин, но его синтез довольно сложен, поэтому там действительно нужен не один ген и все становится намного сложнее.
www.advancedaquarist.com/2006/9/aafeature — вот, тут их десятки разных видов ;)
Автору мегазачет, так рассказывать о таких вещах — это талант. Ждем продолжения.
К сожалению не знаком с популярными книжками по этой тематике. В свое время читал старые советские из серии «Эврика», но это 15 лет назад было, сейчас данные оттуда несколько устарели.
С другой стороны www.books.ru/shop/search?search_type=+&query=%E3%E5%ED%E5%F2%E8%EA%E0&x=0&y=0
Есть куча книг, в аннотации которых говорится что они популярные. Мне кажется если погуглить по названию и автору, то можно еще не заказывая понять, адекват это или нет.
Это про генети… тьфу, биотехнологов :)
После того как мы интегрировали при помощи плазмиды наш ген bl1 в бактерию кишечной палочки, и добились её роста(самокопирования), будут ли полученные колонии этой самой бактерии светится?
Ведь они уже содержат ген свечаения…
спасибо за статью, очень интересно
Пожалуйста, как и в этот раз, напишите заключительную статью — киньте линк в личку.
Статья очень понравилась, читать было легко и интересно. Очень порадовали картинки, продолжайте в том же духе. Мне очень нравятся иллюстрации! Спасибо вам!